His標簽蛋白純化通常采用固定化金屬離子親和層析（IMAC）純化的方法，主要利用介質配體螯合的金屬離子吸附純化表面帶組氨酸殘基的蛋白。由于His標簽可與多種金屬離子（如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，F(xiàn)e2+等）發(fā)生特殊的相互作用，所以可利用蛋白質表面的特性，使之被吸附在凝膠柱上，從而達到分離純化蛋白的目的。組氨酸的殘基上帶有1個咪唑基團，可與Ni2+、Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性結合在金屬離子上，這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質上，因此帶有His標簽的蛋白在經(jīng)過裝配了金屬離子的層析介質時可以選擇性結合在介質上，而其他雜質蛋白則不能結合或僅能微弱結合。結合在介質上的His標簽蛋白可以通過提高緩沖液中咪唑濃度進行競爭性洗脫，從而得到純度較高的His標簽蛋白。

Ni2+、Co2+和Cu2+是His標簽蛋白純化中使用較為廣泛的金屬離子，因為它們在水溶液中與組氨酸具有較好的親和性。其中，Ni2+是親和純化實驗中最常使用的，根據(jù)結合基團不同，Ni2+親和層析柱可分為兩類：一類是Ni-IDA，另一類是Ni-NTA。Ni2+有六個螯合價位，其中Ni-NTA螯合了四價，Ni-IDA螯合了三價。所以，IDA的載量要比NTA高，在同樣條件下，Ni-IDA洗脫時所需的咪唑濃度要高于Ni-NTA，但其弱結合能力使金屬離子在洗脫時容易浸出，與目的蛋白緊密結合，從而導致分離蛋白產(chǎn)量偏低，產(chǎn)品不純及金屬離子污染等問題。NTA的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落，所以實際實驗中往往選擇Ni-NTA親和層析柱進行蛋白純化。

（1）取2支15ml的試管，每管加入10ml LB培養(yǎng)基、10μl菌種和10μl相應的抗生素，放入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱180rpm過夜培養(yǎng)16h。

（2）取800μl上述菌液加入800ml培養(yǎng)基，再加入800μl相應抗生素，放入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱180r/min培養(yǎng)4h，使培養(yǎng)液OD600達到0.6~0.8。

（3）加入800μl IPTG誘導劑，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

2.2 菌體破碎：

（1）收集培養(yǎng)的菌液，8000r/min 4℃離心10min，收集管底的菌體。

（2）根據(jù)實驗需要取適量菌體加入10ml PBS緩沖液，渦旋振蕩。

（3）把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進行破碎。將超聲儀器的超聲探頭伸入菌液中，注意不觸及管底和管壁，每次超聲破碎20s，總共四次，中間間隔半分鐘（破碎時間、破碎次數(shù)和間隔時間可視具體情況而定）。

（4）破碎后的菌液會顯得比較澄清，此時將菌液于4℃離心機中8000r/min離心10min，離心時間也可延長。

（5）離心后分離上清和沉淀，分別留樣，通過SDS-PAGE電泳檢測目的條帶在上清中還是沉淀中。

2.3 蛋白純化：

（1）菌液破碎離心后的上清液中加入2M咪唑溶液使終濃度為20mM，樣品總體積為10ml。

（2）過柱子的樣品最好過0.45μm的濾膜，避免堵柱。

（3）可溶性蛋白純化：

a 平衡緩沖液：PH7.4的50mM磷酸緩沖液0.5M NaCl，含20mM咪唑。

b 洗脫緩沖液：PH7.4的50mM磷酸緩沖液0.5M NaCl，含500mM咪唑。

c 取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎后的上清液10ml以0.5ml/min上樣，然后以2ml/管，分管收集。

d 用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。

e 用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。

f 再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20%乙醇，封閉，以備下次使用。

g 此方法是通用方法，若效果不佳，可用50 mM，100 mM，300 mM，500 mM分段洗脫，洗脫5-10個柱體積左右，1-2ml/min，2ml/管收集。

h 將收集的各濃度梯度洗脫下來的蛋白，取樣，進行SDS-PAGE。

i 根據(jù)SDS-PAGE電泳圖，若有蛋白，則收集蛋白進行透析，若上清無條帶而沉淀中有條帶，則用變性條件下沉淀，做沉淀純化。

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His標簽蛋白不掛柱

可能的原因及建議：

金屬離子的選擇：如果選擇的是Ni2+或Co2+可以換成作用力更強的Cu2+或Zn2+。

超聲功率：超聲功率太小可能導致蛋白沒有釋放，功率太大又可能會使蛋白炭化，所以要調(diào)節(jié)超聲功率到合適水平，并且在超聲之前加入溶菌酶。

緩沖液條件：適當提高緩沖液PH、降低咪唑濃度或改變鹽濃度都可能提高His標簽蛋白的掛柱能力。

His標簽是否丟失：通過Western Blot或Anti-His的抗體檢查His抗體是否表達。

標簽暴露情況：蛋白表達過程中，標簽暴露可能不充分，可加入適量變性劑（脲、鹽酸胍）使標簽充分暴露。若不能采用變性條件純化，就只能通過增加His標簽長度或改變His添加的位置來解決。

His標簽蛋白掛柱后洗脫不掉

可能的原因及建議：

洗脫條件太溫和：可以通過降低pH和增加咪唑濃度找出最佳的洗脫條件。但PH低于3.5可能會導致Ni2+脫落，這時候就需要采用咪唑競爭性洗脫法。

蛋白沉淀在柱子上：嘗試減少上樣量和孵育時間，避免蛋白沉淀。

非特異性吸附：添加非離子去污劑洗脫緩沖液或增加NaCl的濃度。

雜帶較多

可能的原因及建議：

檢查超聲破碎的條件是否太劇烈或溫度控制是否合適。

蛋白酶可能會導致部分蛋白被降解，可加入蛋白酶抑制劑。

采用咪唑競爭性洗脫，此外在咪唑洗脫前增加0.5M PH=5的醋酸緩沖液洗脫，在平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton可以避免因為疏水作用導致的非特異性吸附，這樣可以明顯減少電泳雜帶。

蛋白相互作用或者形成聚合體導致雜帶增加，前者可以通過添加表面活性劑和增加離子強度得到改善，后者可以在緩沖液和樣品中加入1-2mM巰基乙醇避免，并且選擇NTA瓊脂糖凝膠。

蛋白純度不夠

可能的原因及建議：

優(yōu)化金屬離子：純度不夠可能是由于宿主蛋白中一些含有His的天然蛋白結合在柱子上，可以通過更換結合能力較弱的Co2+，使含有His的雜質蛋白無法結合而標簽蛋白可以結合。

優(yōu)化結合洗脫條件：尋找最合適的結合洗脫條件，將標簽和雜質盡可能分開

雙標簽純化：可以在重組蛋白上同時添加His標簽和其他標簽（如StrepⅡ ），通過兩步親和層析，提高目的蛋白純度。

多步驟純化：在親和層析后可進行凝膠過濾層析或離子交換層析，根據(jù)目的蛋白大小或帶電荷等性質將蛋白和雜質進一步區(qū)分開。

還有其他實驗因素造成的原因，可以私信一一提供建議

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