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一、自噬簡介
自噬（autophagy=self-eating）意為自體吞噬，是真核細胞在自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）的調控下利用溶酶體降解自身細胞質蛋白和受損細胞器的過程。自噬可防止細胞損傷，促進細胞在營養缺乏的情況下存活，并對細胞毒性刺激作出反應。自噬包括生理條件下的基礎型自噬和應激條件下的誘導型自噬。前者是細胞的自我保護機制，有益于細胞的生長發育，保護細胞防止代謝應激和氧化損傷，對維持細胞內穩態以及細胞產物的合成、降解和循環再利用具有重要作用；但自噬過度可能導致代謝應激、降解細胞成分，甚至引起細胞死亡等。研究表明，自噬能在細胞穩態、衰老、免疫、腫瘤發生及神經退行性疾病等多種生理病理過程中發揮重要作用。
2.自噬的分類
根據細胞物質通向溶酶體途徑的不同，自噬一般分為三類：巨自噬?(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)。
巨自噬其特征是雙層膜結構“自噬體”的形成，自噬體包裹胞質成分，如蛋白質聚集體、損傷或衰老的線粒體、過氧化物酶體等，最終與溶酶體融合。
微自噬則是溶酶體直接內陷成囊泡，包裹部分胞質進入溶酶體，沒有獨立的雙層膜自噬體形成。
分子伴侶介導的自噬則不依賴囊泡結構，直接借助伴侶蛋白Hsc70，特異性地降解帶有獨特識別五肽基序（KFERQ樣）的靶蛋白，溶酶體膜上的受體蛋白LAMP2A識別結合蛋白暴露的KFERQ基團，引導靶蛋白進入溶酶體降解，具有高度選擇性。
當然，部分巨自噬和微自噬也會對“貨物”有選擇性，比如Cvt途徑、過氧化物酶體自噬和線粒體自噬、內質網自噬等。這些選擇性自噬的主要過程與非選擇性自噬基本類似，但選擇性自噬有自己特異的受體蛋白介導特定的包含物配體，即有識別底物的過程。
圖2
此外，據細胞所處環境及自噬發生的程度不同，細胞自噬還可分為基礎自噬和誘導自噬。基礎自噬是一種在大多數細胞中持續發生而水平相對較低的細胞自噬過程，對細胞內物質的更新及內穩態的維持具有不可或缺作用；誘導自噬則屬于一種應激狀態，其發生程度明顯強烈，在細胞應對外界惡劣環境、維持生存中發揮重要功能。
三、自噬的過程
巨自噬作為經典的細胞自噬，也是過程最復雜的一種自噬。其發現最早，機制研究最清晰，因此也被狹義的等同為細胞自噬，下文中的自噬不作特別說明即為巨自噬。其發生可分為以下幾個階段：
1)自噬誘導階段（Induction）：主要通過ATG1/ULK1復合體(包括ATG1/ULK1、ATG13、FIP200和ATG101)來介導。在營養豐富的條件下，雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)與ATG1/ULK1復合物結合，會磷酸化ATG1/ULK1和ATG13，導致它們失活，抑制自噬發生。當缺乏營養或用雷帕霉素（Rapamycin，mTORC1復合物抑制劑）處理時，mTORC1從復合物中解離，ATG1/ULK1和ATG13磷酸化水平降低，ATG1/ULK1復合物形成，自噬啟動。（注：ATG1即Yoshinori Ohsumi發現并命名的第一個酵母自噬相關基因，ULK1是哺乳動物中ATG1的同源蛋白。）
2)前體成核階段（Nucleation）：主要由Vps34-Beclin 1復合體介導，該復合物由Vps34（PIK3C3）、Beclin 1（ATG6）、Vps15（PIK3R4或p150）和ATG14組成，可生成Ptdins3P，招募其他效應蛋白，介導吞噬泡成核；還可召集ATG12-ATG5-ATG16復合物以及LC3，并通過后兩者促進吞噬泡膜的延伸。
3)延伸階段（Elongation）：自噬前體形成之后，吞噬泡膜會繼續延伸，直至完全包裹內容物。在此過程中，兩個泛素樣蛋白(UBL)修飾系統發揮關鍵作用。
第一個是ATG5-ATG12復合體。ATG12作為類泛素蛋白，在ATG7（類E1泛素活化酶）和ATG10（類E2泛素轉移酶）的作用下，結合ATG5，生成ATG12-ATG5復合物。隨后該復合物又與ATG16結合形成ATG12-ATG5-ATG16復合物，該復合物具有類E3泛素連接酶活性。
第二個是ATG8/LC3系統。ATG8（LC3）作為泛素樣蛋白，首先被半胱氨酸蛋白酶ATG4切割成胞漿可溶性的LC3-I，然后被ATG7（類E1酶）激活處理，在ATG3（類E2酶）和ATG12-ATG5-ATG16復合物的作用下，最后與脂質磷脂酰乙醇胺(PE)共價結合，形成脂溶性的LC3-PE(LC3-II)，參與自噬體的延伸。
4)自噬體成熟階段：隨著自噬體的擴張和封閉，自噬體經歷成熟過程，包括逐漸清除在自噬體外膜上的ATGs蛋白，招募負責溶酶體傳遞的蛋白和介導與溶酶體融合的蛋白。
5)自噬體與溶酶體融合階段（Fusion）：自噬體與溶酶體融合，首先自噬體外膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體（autolysosome）。隨后自噬體內膜和內容物被溶酶體內的脂酶和蛋白酶降解為小分子，被細胞重新利用。細胞骨架成分和相關的運動蛋白，栓系因子（Tethering factors），磷脂和特定的SNAREs復合物，已經被確定為確保精確和有效融合的重要角色。
圖3
四、自噬相關蛋白
在自噬的發生過程中，有多種自噬相關蛋白可調節和控制自噬形成的不同階段。迄今為止，科學家已在酵母中鑒定出40余個編碼ATG蛋白的基因，并且大多數在酵母和哺乳動物之間高度保守。在哺乳動物細胞中，饑餓誘導的自噬大約受20種核心ATG基因調節，它們在液泡附近被不斷募集，并組裝形成自噬前體。這些基因的分類和作用（圖4）如下：
五、自噬的檢測方法
在生理條件下，細胞自噬活性通常較低。但在饑餓、缺氧和疾病等刺激下會顯著上調。另外，自噬抑制也與某些疾病相關，如癌癥、神經退行性疾病等。選擇理想的檢測方法對于自噬研究至關重要。常用的觀察和檢測方法有∶
1、透射電鏡法
自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，直接在透射電鏡下觀察自噬不同階段的形態變化是一種非常直接的方法。
| 自噬標志 | 形態學特征 | 自噬階段 |
| 隔離膜 | 新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢 | 自噬初期 |
| 自噬小體 | 雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等 | 自噬中期 |
| 自噬溶酶體 | 單層膜，胞漿成分已降解 | 自噬后期 |
表1. 自噬各階段的形態學特征
2、熒光顯微鏡觀察法
LC3全稱MAP1LC3 ，貫穿整個自噬過程，是目前公認的自噬標記物。哺乳動物的LC3可分為三種：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B應用廣泛。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產生胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）相偶聯，形成LC3-II并定位于自噬體內外膜上。自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產生LC3-I循環利用；內膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導致自噬溶酶體中LC3含量很低（圖6）。因此，可以通過熒光顯微鏡觀察內源性LC3或GFP-LC3，實現對自噬發生的檢測。
GFP-LC3單熒光和mCherry-GFP-LC3雙熒光指示系統
自噬形成時，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白轉移至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色或黃色熒光斑點。當自噬溶酶體形成后，酸性環境使GFP熒光淬滅，而mCherry熒光不受影響，自噬溶酶體呈現紅色熒光（圖7）。因此，可以通過LC3熒光指示系統來監測自噬流。
3、Western Blot檢測LC3和p62蛋白的表達量
① 利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化評價自噬形成（圖8）。自噬形成時，胞漿型LC3-I會酶解掉一小段多肽，隨后跟PE結合轉變為膜型的LC3-II。因此可以通過LC3-II/I比值的大小估計自噬水平的高低。
圖8
② 除LC3外，其他自噬底物表達量的變化也可以用于監測自噬流。其中，p62是研究廣泛的一個自噬底物。在自噬體形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶將其降解（圖9），所以p62蛋白的表達量與自噬活性呈現負相關。因此，利用Western Blot檢測p62蛋白的表達量也可以評價自噬水平。
4、基于Keima蛋白的自噬評價
Keima是一種pH敏感型熒光蛋白，利用它在中性和酸性pH中熒光信號不同的特性，可以直觀地反映自噬程 度。將細胞質的Keima傳遞到溶酶體可反映非選擇性自噬，將Keima融合到特定的蛋白(如融合到線粒體靶向序列—mt-Keima)可用于反映選擇性自噬。值得注意是，基于keima的檢測不能在固定細胞中進行，因為這種檢測完全依賴于溶酶體的酸性。
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