過氧亞硝基陰離子（ONOO-）檢測試劑盒-綠色熒光

產品簡介：

過氧亞硝基陰離子（ONOO-）檢測試劑盒是一種利用熒光探針O71 進行過氧亞硝基陰離子檢測的試劑盒。O71 探針本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，在過氧亞硝基陰離子存在的條件下，O71 探針被氧化生成熒光物質 O71F，O71F 的綠色熒光強度與細胞內過氧亞硝基陰離子水平成正比，檢測 O71F 綠色熒光強度就可以知道細胞內過氧亞硝基陰離子的水平。

 在激發波長 488 nm，發射波長 516 nm 附近，使用熒光酶標儀、熒光分光光度計、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測 O71F 熒光強度，從而測定細胞內過氧亞硝基陰離子水平。

 O71 熒光探針對過氧亞硝基陰離子（ONOO-）有較高的選擇性，但是也會與活性羥基反應。

 本試劑盒可以用于各種真核培養細胞的檢測。

產品特點：

1.使用方便：可用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測或激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析；

2.背景低，靈敏度高；

3.線性范圍寬，使用方便。

使用方法：

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

2.熒光探針標記后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

3.探針標記完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的標記情況是否正常。

4.盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

5.對于藥物作用時間較短(小于 2 小時)的細胞，可以先標記探針，后用藥物刺激細胞。對于藥物作用時間較長(6 小時以上)的細胞，先用相應的藥物刺激細胞，后標記探針。

6.O71 染色液為 DMSO 溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

7.使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使 DMSO 溶液集中于管底。

8.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

9.標記的條件因細胞種類而異，根據不同樣本的實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先根據不同的實驗要求、細胞類型、細胞的膜通透性等進行優化，確定最佳條件。以下方法僅供參考。

10.酚紅對 O71 熒光探針的檢測有干擾，需避免。

11.染色后立即進行分析。

12.以下步驟僅做為參考，稀釋比例和孵育時間可根據實際情況來調整。比如，對于某些細胞，如果發現未被刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可降低探針濃度。如果發現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可升高O71 探針濃度，以提高檢測的靈敏度。另外，探針裝載的時間也可以根據情況在 15-60 分鐘內適當進行調整，孵育溫度在 4 -37 ℃ ℃內調整。

13.必須使用熒光檢測專用的黑色 96 孔板。

1. 探針染色工作液配制：

根據樣本數量，用 HBSS 將 O71 熒光染料 100-500 倍稀釋，配制成染色工作液。

2. 細胞探針標記

2.1 對于貼壁細胞，可以進行原位標記

1）培養皿/培養板準備細胞樣本。

2）待細胞生長到合適豐度，吸除培養液，加入適量 37℃預熱的含探針工作液。于生長狀態下孵育 20 分鐘～

30 分鐘（具體孵育時間需根據細胞類型而定，需預實驗優化）。

3）移除染色液，用 PBS（pH7.4）洗滌細胞 3 次。

4）熒光顯微鏡（含合適濾片）或流式細胞儀、熒光酶標儀下觀察。最大激發/發射波長為 488 / 516 nm。

2.2 對于懸浮細胞

1）離心，吸除上清。

2）利用 37℃預熱的探針工作液 100-200 μl 重懸細胞，于生長狀態下孵育 20 分鐘～30 分鐘（具體時間需根據細胞類型而定，需預實驗優化）。

3）離心，吸除染色液，加入 PBS（pH7.4）重懸細胞，洗滌 3 次。

4）流式細胞儀、熒光酶標儀檢測。最大激發/發射波長為 488 / 516 nm。

3．檢測：

對于原位標記探針的樣品可以用熒光酶標儀檢測，或者熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析（需要有相關的熒光強度分析軟件）。

或收集細胞后標記探針然后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

使用 488 nm 激發波長，516 nm 發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。

過氧亞硝基陰離子濃度高則熒光強度強。

O71F 的熒光光譜和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的參數設置進行檢測。

注意事項：該產品僅供科研實驗使用，未經允許不得用于其它用途！以實際收貨產品說明書為準，網站說明書僅供參考。